渐渐习惯了现代生活的美国队长史蒂夫·罗杰斯（克里斯·埃文斯ChrisEvans饰），在一次行动后隐隐嗅到神盾局内部所弥漫出来的凶险气。而当得知神盾局正秘密进行的“洞察计划”后，他更为此感到愤怒。某天，神盾局指挥官尼克-法瑞（塞缪尔·杰克逊SamuelL.Jackson饰）遭到一群武装分子袭击，他拼尽全力将一支U盘交到美国队长手中，这里面藏着该局二战以来最重要且最可怕的秘密。在此之后，美国队长因涉嫌杀害尼克而遭到前局长亚历山大·皮尔斯（罗伯特·雷德福/RobertRedford饰）的通缉和追杀，逃亡中他得到黑寡妇（斯嘉丽·约翰逊ScarlettJohansson饰）和退伍老兵“猎鹰”（安东尼·麦凯AnthonyMackie饰）的帮助。